骨破坏相关因子在类风湿关节炎患者体内表达研究
【摘要】 目的 检测类风湿关节炎(RA)患者血清、滑膜液中骨保护素(OPG)、核刺激因子受体配体(RANKL)、核刺激因子受体(RANK)、白细胞介素-17(IL-17)和前列腺素E-2（PGE2）水平，探讨其与RA发生发展的相关意义，明确类风湿关节炎骨吸收破坏的分子生物学机制。方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测30例RA患者与30例同期门诊体检的健康成人病人（作为正常对照组）血清、滑膜液中OPG、RANKL、RANK、IL-17和PGE2水平, 重点观察RANKL、OPG水平相对变化情况，分析上述因子水平与RA骨吸收破坏的相关性。结果RA患者血清、滑膜液中OPG、RANKL、RANK、IL-17和PGE2水平明显高于对照组( P <0.05), 但RANKL含量增加最明显，RANKL/OPG的比值增加程度比OPG增加明显。结论 RA病人IL-17和PGE2等细胞因子最终通过对RANKL/RANK/OPG系统平衡的影响参与RA骨破坏。RANKL与OPG的表达比例与破骨细胞的分化、增生、活性呈正相关。局部微环境中RANKL与OPG的相对比值决定骨组织中破骨细胞与成骨细胞功能倾向，决定局部骨组织是吸收、破坏还是增生，而且决定骨的破坏程度。healthy individuals
【关键词】类风湿性关节炎; 骨保护素；核刺激因子受体配体; 核刺激因子受体；白细胞介素-17；前列腺素E-2
The expression and the significance of cytokine related to bone destruction in patients with rheumatoid arthritis
FAN Qiu-gui,department of Orthopaedics of Yangquan Chealthy individualsl Group General Hospital,Yangquan 045000,China; YANG Min,department of Orthopaedics,Third Hospital,Peking University.
【Abstract】 Objective To detect the expression of osteoprotegerin(OPG), ligand of receptor activator of NF-kB(RANKL), receptor activator of NF-kB(RANK), interleukin-17(IL-17) and PGE2 in serum, synovial fluid and to identify their role in rheumatoid arthritis (RA) and and to discuss the molecular biology mechanism of bone tissue destruction in rheumatoid arthritis. Methods The serum ,synovial fluid were obtained from 30 patients with RA and from 30 HEALTHY INDIVIDUALS(ostehealthy individualsrthritis) outpatients,which were used as control groups. Levels of OPG,RANKL,RANK,IL-17 and PGE2 in serum and synovial fluid were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The correlation of the bone absorption and the level of these cytokine is analyzed and the ratio of RANKL/OPG is observed as the focal point .
Results the levels of OPG, RANKL,RANK,IL-17 and PGE2 in both serum and synovial fluid of patients with RA were significantly increased compared with the control groups( P <0.05) but the ratio of RANKL/OPG is increased more.. Conclusion The bone destruction is directly related to the balance of the RANKL/RANK/OPG system
which is regulated by IL-17 and PGE2 in RA . The differentiation,proliferation ,activation of the osteoclast are under control of RANKL/RANK/OPG system..
bone absorption or hyperplasia and the extent of the bone destruction depend on the ratio of RANKL and OPG in the local microenvironment.
【Key words】 rheumatoid arthritis; osteoprotegerin; receptor activator of
NF-κB ligand receptors; receptor-activator of NF-κB; interleukin-17; PGE2
作者单位: 045000 山西省阳泉市阳煤集团总医院骨科(樊秋贵)；北大三院骨科（杨民）
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis ,RA) 是一种严重影响人类健康,以关节滑膜及周围结缔组织异常增生、关节进行性破坏为主的慢性自身免疫性疾病。近年来,细胞因子的介导作用和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)、核刺激因子受体配体(ligand of receptor activator of NF-kB ,RANKL)、核刺激因子受体(receptor activator of NF-kB, RANK)在
RA疾病发生、发展的研究中日益受到重视,本研究通过对RA血清、滑膜液中OPG、RANKL、RANK、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)和前列腺素E-2（PGE2）水平的检测，分析其与RA的相关性，以探讨其在RA发病中的作用。
材料与方法
一、 材料 选取本院2003年2月～2004年10月住院患者。(1) 对照组:30例,其中男12例,女18 例,年龄43～84 (64±9)岁,因HEALTHY INDIVIDUALS门诊就诊。经临床与实验室检查除外类风湿关节炎以及其他传染病等病史。 (2)RA组:30例,其中男14例、女16 例,年龄37～83 (65±9)岁。经临床与实验室检查均符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准[1]，无其他传染病等病史。标本采集前2周均未使用类固醇激素及免疫抑制剂，膝关节滑膜液、空腹肘静脉外周血采集方法按操作常规,在严格无菌条件下进行。标本取出后立即于3 000r/min 离心15min ,收集滑膜液上清及血清,于—20℃冰箱保存备检。
二、 血清及滑膜液OPG、RANKL、RANK、IL-17和PGE2的检测 采用酶联免疫吸附( ELISA) 法,检测血清及滑液OPG、RANKL、RANK、IL-17和PGE2的水平，操作按说明书进行,所有检测试剂盒均为美国R&D 公司产品。
三、 统计学处理 计量资料用均数±标准差(x±s) 表示。资料应用SPSS 10.0 软件进行统计学分析,两组数据比较采用t 检验。
结 果
RA患者血清及滑液中OPG水平较对照组增高(P <0.05)，RANKL、RANK、IL-17和PGE2水平明显高于对照组(P <0.05),且滑液中含量较血清中明显高。详见表1。
表1 RA患者血清及滑膜液OPG、RANKL、RANK、IL-17和、PGE2水平( x ±s，n30)
Tab.1 The expression of OPG, RANKL,RANK,IL-17 and PGE2 in serum, synovial fluid in RA( x ±s，n30)
组别Groups OPG(μg/ L) RANKL(μg/ L) RANK(μg/ L) IL-17(pg/ml PGE2(μg/L)
对照组
Gontrol group
血清
Serum 滑膜液
Synovial fluid
0.0868±0.0351
0.1564±0.0527
0.1031±.0458
0.2173±0.0874
0.0921±0.0420
0.1764±0.0751
27±16
41±5
15±10
17±11
RA组
RA group
血清
Serum 滑膜液
Synovial fluid
0.1107±0.0292*
0.2192±0.0403Δ
0.3620±0.0405*
0.5774±0.0821Δ
0.2230±0.0412*
0.2903±0.0862Δ
149±37*
291±47Δ
219±103*
523±112Δ
注: 与对照组血清水平比较, * P＜0.05；与对照组滑膜液水平比较，ΔP＜0.05
Note: compared with serum of control group, * P＜0.05；compared with synovial fluid of control group, * P＜0.05
讨 论
类风湿关节炎以淋巴细胞、巨噬细胞和滑膜细胞在关节内的侵袭性和组织破坏性浸润为特征，骨吸收和骨破坏是类风湿关节炎的一个重要特征。
类风湿关节炎的骨质吸收和破坏有以下几种不同类型 ［6］ :血管翳直接侵害关节边缘引起局灶性骨侵蚀;局灶性软骨下骨侵蚀;炎症关节的关节端骨量减少。所有类型的骨破坏与破骨细胞的功能有直接关系。破骨细胞来源于关节滑膜组织中骨髓干细胞/巨噬细胞，同时大量的研究证明关节滑膜组织中的成纤维细胞（synovial fibroblasts）具有分化为破骨细胞的潜能 ［7］ 。骨吸收是破骨细胞在成骨细胞（os-teoblast，OB）参与下侵蚀骨质的生物学功能，体现OB的接触依赖过程 ［8］ ，成骨细胞可能首先产生一种或多种酶介体，再作用于破骨细胞的前体细胞使之向破骨细胞分化，破骨细胞分化因子（RANKL）就是这样一种酶介体 ［9］ 。其功能受骨保护素（OPG）反馈调节 ［10］ 。破骨细胞表达RANK是RANKL唯一的受体, RAN KL一旦与RANK结合就会刺激前体破骨细胞分化, 活化成熟的破骨细胞, 引起骨吸收。而OPG可与膜受体RANK竞争性结合RANKL , 但OPG对RANKL的竞争结合能力比RANK更强, 从而阻断骨吸收信号的传递。多数研究发现类风湿关节炎骨破坏也是通过RANKL/RANK/OPG系统活化破骨细胞而产生的，但RANKL/RANK/OPG在RA体内表达的研究结果不一致。有些研究认为RA体内OPG浓度绝对值下降，另外一些研究认为OPG浓度绝对值增高，但RANKL/OPG比值明显增高。Vanderborght研究发现早期RA 病人血清中OPG增高，晚期降低甚至无法检测到，而且OPG在正常人体内其浓度随着年龄增加而有所变化。从本组结果看OPG在血清中浓度变化非常大，OPG在RA不同病人体内浓度可能是动态变化的。，因此上述结果不一致可能和病程的不同时间段有关。但所有研究结果均认为RANKL/OPG比值的增高是骨破坏的根本前提。本研究结果与此相符。
Pulsatelli L,Dolzani P,Silvestri T,et al
Soluble receptor activator of nuclear factor- kappaB Ligand (sRANKL)/osteoprotegerin balance in ageing and age-associated diseases.
Biogerontology. 2004;5(2):119-27.
Feuerherm AJ,Borset M,Seidel C,et al.
Elevated levels of osteoprotegerin (OPG) and hepatocyte growth factor (HGF) in rheumatoid arthritis.
Scand J Rheumatol. 2001;30(4):229-34.
Vanderborght A,Linsen L,Thewissen M,et al.
Osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand mRNA expression in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls.
J Rheumatol. 2004 Aug;31(8):1483-90.
在RA中，RANKL表达量的绝对增加和OPG生成受抑制是导致RANKL/OPG比值升高进而产生骨破坏的根本原因。而这两种细胞因子的产生
而这一系统也受类风湿关节炎发病过程所产生的各种细胞因子的影响和调控。
在RA，RANKL/OPG比值增高与细胞因子的产生机制有关。目前这种细胞因子的产生机制尚未完全阐明， T细胞依赖机制和非T细胞依赖机制两种学说。
6 Gravallese EM.Bone destruction in arthritis.Ann Rheum Dis，2002，61（Suppl2）:ii84-86.
7 Takayanagi H，Oda H，Yamamoto S.A newmechanism of bone destruc-tion in rheumatoid arthritis:synovial fibroblasts induce osteoclastogenesis.Biochem Biophys Res Commun，1997，240（2）:279-286.
8 Shimizu-Ishiura M，Kawana F，Sasaki T.Osteoprotegerin administra-tion reduces femural bone loss in ovariectomized mice via impairment of osteoclast structure and function.J Electron Microsc（Tokyo），2002，51 （5）:315-325.
9 Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin:a novel secreted protein involved in the regulation of bone density.Cell，1997，89（2）:309-319.
10 Tsuda E，Goto M，Mochizuki S.Isolation of a novel cytokine from hu- man fibroblasts that specifically inhibits osteoclastogenesis.Biochem Biophys Res Commun，1997，234（1）:137-142.
在类风湿性关节炎的关节腔内，除局部浸润的激活T淋巴细胞产生 OPGL外， 滑液细胞也大量表达 OPGL。动物试验已经表明 [20]，佐剂性关节炎的模型大鼠用 OPG 治疗可以预防或减轻骨和软骨损害。应用 OPG抑制 OPGL 的生物活性已成为免疫性骨关节疾病治疗的又一新思路
多数研究认为滑膜组织内大量处于高度激活状态的淋巴细胞及浆细胞，产生大量的炎症细胞因子及参与免疫反应的物质如白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、免疫球蛋白G、A、M (IgG、IgA、IgM)和补体3（C3）等；免疫复合物激活补体，引起免疫损伤；细胞因子又加剧了炎症反应和刺激滑膜细胞的增生，形成自我加剧的恶性循环。一些研究认为RA的早期患者的关节液中T细胞相关的细胞因子（IL-2，4，13和17）和基质细胞因子（bFGF和EGF）水平显著增高。
成胜权,张国成,李琦,等.类风湿关节炎患者血清和关节液细胞因子水平的变化及临床意义[J].细胞与分子免疫学杂志,2001,17(4):353-355.
也有一些临床和实验观察发现T细胞在类风湿性关节炎发病中并不明显活化，
Yamannishi Y,Firestein GS.Pathogenesis of rheumatoid arthritis:The role of synoviocytes[J].Rheuma arthritis,2001,27(2):355-368.
临床上也可看到针对类风湿性关节炎的免疫抑制药物不能有效地终止病情发展，只能起到暂时缓解作用。这是T细胞依赖机制不能合理解释的，同时提示非T细胞依赖机制的存在。1985年, Fassbender首次提出类风湿性关节炎滑膜细胞具有转化细胞特征，类风湿关节炎 FLS 发生不可逆的转变，即使脱离炎性环境的条件下仍可以保持持续的活化状态，这些细胞可以持续迁移、侵袭而不需要外源性刺激。类风湿性关节炎FLS与软骨共植入SCID小鼠体内60天后仍然表现出侵蚀软骨的特性，而骨性关节炎和正常成纤维细胞则无此特性。有人提出滑膜细胞的转化可能是类风湿性关节炎发病的首发环节，
非T细胞依赖途径在类风湿关节炎的病情发展中发挥着重要作用，类风湿关节炎FLS即可以因为基因转变获得转化特性，而主动对软骨，骨侵蚀，又可以在各种细胞因子及生长因子作用下加强增殖和侵袭性。
也有学者提出RA可能有着不同的发病机制，但是所有类型的RA 都与局部和全身骨丢失有关，近年研究发现尽管RA的发病机制可能不同但RA导致骨破坏机制是相同的，都与RANKL/RANK/OPG系统有密切关系。而许多细胞因子（包括RA发病过程中所涉及的一些因子）参与了对这一系统的调控。
如白细胞介素(IL)－1α和IL－1b、TNF，转化生长因子－b(TGF－b)及其超家族成员骨形态蛋白(BMPs)、成骨细胞分化因子1，25(OH)2D3、抗骨吸收剂17b－雌二醇(17b－E2)、血管活性肠肽和钙离子等，均可刺激OPG mRNA和OPG蛋白的表达；前列腺素E2(PGE2)、糖皮质激素、甲状旁腺激素(PTH)、免疫抑制剂、雌激素受体拮抗剂（ICI182和ICI1780）等，则抑制OPG mRNA和蛋白的表达。在RA病变过程所产生的细胞因子与这一系统的关系目前研究较少。
Lacey DL, Timms E, Tan HL, et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell,1998, 93: 165-176.
Miossec P.IL-17 in rheumatoid arthritis:a new target for treatment or just another cytokine[J].Joint Bone Spine,2004,71(2):87-90
研究特异性抑制剂可能是治疗炎症性关节炎的关节破坏的新手段。
为此我们对RA患者血清、滑膜液中OPG、RANKL、RANK、IL-17和PGE2的水平进行了检测,并与正常对照组进行比较, 以探讨其在RA发病机制中的意义,为RA的防治提供依据。
本研究结果显示，RA患者血清RANKL、RANK、IL-17和PGE2的水平显著高于正常对照组( P <0.05)，且RA患者滑膜液中RANKL、RANK、IL-17和PGE2水平又较血清中高。而OPG在RA患者血清和滑膜液中的水平与HEALTHY INDIVIDUALS对照组比较增高，( P <0.05)，但RANKL的增高更为明显，即RANKL/OPG比值增高，表明了RA病人中抑制骨破坏的因素降低，说明类风湿性关节炎病人中PGE2与IL-17可以抑制OPG的产生，而导致RANKL与RANK的相对高表达继而诱导OC形成，从而导致RA病人骨关节破坏。
RA 患者由于滑膜液中高浓度的TNF-α、IL-1β等炎症因子的存在,诱导关节软骨细胞、滑膜细胞、浸润的单核/ 巨噬细胞等表达IL-17。过度表达的IL-17 部分随体液循环释放入血,发挥相应的生物效应; IL-17 还可诱导关节局部高效表达IFN-γ,刺激软骨细胞、滑膜细胞iNOS、COX-2 基因的表达,从而诱导产生大量的PGE2。这些因子共同作用,导致关节滑膜组织异常增生、新生微血管翳形成、滑膜肿胀充血、关节退变等，。
Miossec P.IL-17 in rheumatoid arthritis:a new target for treatment or just another cytokine[J].Joint Bone Spine,2004,71(2):87-90.
此外,RA 血清及滑液中高浓度的IL-17促进了外周血及滑液中Th1细胞的发育,诱导Th1 细胞因子的大量产生,同时抑制Th2细胞的功能,使外周血及滑膜液中Th1 细胞明显增,Th1/ Th2 比例进一步失调,加剧RA病情。
RANKL和OPG也是RA中的关键调节因子，活化的T 淋巴细胞表达RANKL可能为RA中免疫系统与骨代谢提供联系。活化的T 淋巴细胞通过RANKL介导滑膜巨噬细胞向破骨细胞（OC）分化,引起骨丢失。在佐剂性关节炎动物模型中,炎症活动部位可检测到RANKL的表达且与增加OC生成活化相一致,从而导致严重骨与关节破坏,给予OPG可阻抑骨关节的破坏[6]。提示OPG/RANKL/RANK系统可能是联系骨代谢与免疫系统之间的桥,RANKL 和激活的T细胞是这个桥梁的两个重要支点。激活的T淋巴细胞表达RANKL,与破骨细胞前体细胞或成熟破骨细胞表面上的RANK结合后,促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达OPG可与RANKL竞争性结合,从而阻断RANKL与RANK之间的相互作用。
用OPG可以抑制RA病人的局灶性骨侵蚀的理论基础来源于以下观察:局灶性骨侵蚀中有破骨细胞的存在;在滑膜液中RANKL和RANK的表达升高。本研究结果表明，RANKL/OPG在RA病人比值增高，表明了RA病人中抑制骨破坏的因素降低，在RA病人中补充OPG可能为RA病人骨破坏的治疗提供新的途径。
在体外,激活的T 细胞通过表达RANKL 可直接启动破骨细胞生成。在体内, 全身性的T 细胞激活可导致RANKL 依赖性的破骨细胞生成作用增强以及骨量丢失,而这些作用均可被OPG阻断[8]。T 细胞促进骨质吸收有两个途径, 直接途径是RANKL、RANK通路,间接途径是分泌TNF-α、IL-17等引起炎症的细胞因子。另一方面,激活的T 细胞分泌的IFN-γ可以间接阻断RANKL、RANK 介导的NF-kB 和JNK通路,从而抑制了破骨细胞生成[9] 。
所有研究表明，RANKL 的表达与骨关节病变之间有必然的联系,应用OPG阻断RANKL、RANK通路给类风湿性关节炎的治疗提供了一个新的途径。IL-17和PGE2水平的升高与RA病情密切相关 ,其在RA的发病过程中扮演着重要作用。但联系OPG/RANKL/RANK系统与炎症反应的分子机制尚需进一步研究。
参 考 文 献
1 Arnet FC，Edworthy，Bloch DA,et al. The American rheumatism association 1987 criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum,1988,31:315-324
2 姚航平，李敏伟，张立煌，等。滑膜成纤维细胞环氧化酶-2和诱导型一氧化氮合酶在类风湿关节炎中的表达。中华检验杂志，2002,6:345-348
3 Gracie JA ,Forsey RJ ,Chan WL ,et al. A proinflammatory role for IL-17 in rheumatoid arthritis. J Clin lnvest ,1999 ,104 :1337-13391
4 Olee T ,Hashimoto S ,Quach J ,et al. IL-17 is produced by articularchondrocytes and induces proinflammatory and catabolic responses.J Immunol，1999 ,162 :1096-11001
5 Leung BP ,McInnes IB ,Esfandiari E ,et al. Combined effects of IL-12 and IL-17 on the induction of collagen2induced arthritis. J Immunol ,2000 ,164 :6495-65021
6 Romas E , Gillespie MT , Martin TJ . Involvement of receptor activator of NF-κb ligand and t umor necrosis factor-α in bone destruction in rheumatoid arthritis. Bone ,2002 ,30 :340～6.
7 Wong BR , Rho J , Arron J et al . TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptorfamily that activates c-jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem , 1997，272：25190-25194
8 Kong YY, Feige U , Sarosi I et al . Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. Nature，1999， 402：304-309
9 Takayanagi H , Ogasawara K, Hida S et al . T-cell2mediated regulation of osteoclastogenesis by signaling cross-talk between RANKL and IFN-gamma. Nature , 2000 , 408 :300-305
10
Tpkuda H,Kanno Y,Ishisaki A,et al.Interleukin (IL)-17 enhances tumor necrosis factor-alpha-stimulated IL-6 synthesis via p38 mitogen-activated protein kinase in ostoblasts[J].J Cell Biochem,2004,91(5):1053-1061.
